酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的研究與應(yīng)用

本書主要圍繞β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)表征和催化機(jī)理研究展開。書中以酒酒球菌產(chǎn)β-葡萄糖苷酶為出發(fā)點(diǎn)，首先分析了β-葡萄糖苷酶之間的進(jìn)化水平和同源關(guān)系，其次又通過異源表達(dá)技術(shù)得到重組β-葡萄糖苷酶，并進(jìn)一步探究了該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理，為提高β-葡萄糖苷酶的催化效率提供了理論依據(jù)。此外，本書還以商業(yè)β-葡萄糖苷酶作為對(duì)比，分析了重組β-葡萄糖苷酶對(duì)赤霞珠葡萄酒品質(zhì)特性的影響，拓寬了該重組酶在食品發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用前景。
本書不僅可供食品酶學(xué)等領(lǐng)域科研人員與相關(guān)專業(yè)師生參考，同樣也適合果酒發(fā)酵從業(yè)者閱讀。

1.首部針對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行系統(tǒng)研究與闡述的專著。 2.介紹以分子生物學(xué)方法對(duì)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行同源分析、異源表達(dá)和分離純化重組酶的實(shí)驗(yàn)方法，以及酶學(xué)結(jié)構(gòu)性質(zhì)分析、催化機(jī)理等研究方法。 3.探討了重組酶在果酒發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用，拓寬了重組酶在食品發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用前景。

近年來，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，尤其是生物信息學(xué)、分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，為人們深入認(rèn)識(shí)酶的結(jié)構(gòu)功能和催化機(jī)理提供了更多可能。
作為一種纖維素酶，β-葡萄糖苷酶廣泛應(yīng)用于生物質(zhì)能源轉(zhuǎn)化、食品和醫(yī)療等領(lǐng)域。在β-葡萄糖苷酶的眾多來源中，微生物來源的β-葡萄糖苷酶具有產(chǎn)量高、價(jià)格低廉、催化效率高等優(yōu)點(diǎn)，一直受到廣大科研人員的關(guān)注。目前，研究人員已對(duì)微生物來源的β-葡萄糖苷酶作了大量研究，但這些研究主要關(guān)注于黑曲霉和酵母菌來源的β-葡萄糖苷酶，而對(duì)于乳酸菌（酒酒球菌）來源的β-葡萄糖苷酶的研究較少，關(guān)于其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)和催化機(jī)理也缺乏必要的闡釋。
酒酒球菌（Oenococcus oeni ）是葡萄酒發(fā)酵過程中應(yīng)用最多的一類乳酸菌，除了可以降低酒的酸度外，其所產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶還可以將葡萄酒中糖苷鍵合態(tài)的香氣化合物轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的香氣物質(zhì)，從而顯著提升葡萄酒的香氣水平。
為深入了解和闡釋?duì)?葡萄糖苷酶的酶學(xué)性質(zhì)和催化機(jī)理，本書對(duì)酒酒球菌來源的β-葡萄糖苷酶進(jìn)行了系統(tǒng)研究與概述。首先是酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源進(jìn)化分析，這對(duì)于酶的功能預(yù)測及新型β-葡萄糖苷酶資源的開發(fā)具有指導(dǎo)意義；其次，通過基因克隆和異源表達(dá)技術(shù)分離得到了來自酒酒球菌SD-2a 的重組β-葡萄糖苷酶BGL0224，研究該重組酶的酶學(xué)性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和催化機(jī)理，不僅可以加深對(duì)β-葡萄糖苷酶乃至糖苷水解酶家族的認(rèn)識(shí)，也可以為提高β-葡萄糖苷酶的催化效率提供理論依據(jù)；此外，以商業(yè)β-葡萄糖苷酶作為對(duì)比，分析重組β-葡萄糖苷酶BGL0224 對(duì)赤霞珠葡萄酒品質(zhì)特性的影響，拓寬了該重組酶在食品發(fā)酵工業(yè)的應(yīng)用前景，對(duì)于提升我國果酒的品質(zhì)具有重要意義。
為使讀者獲得更好的閱讀體驗(yàn)，本書中的一些彩圖以及書中提及的一些生物信息學(xué)分析工具，將以電子文檔形式提供，讀者可掃描下方二維碼查閱。
編寫分工方面，本書第1 章由李鵬燕編寫，第2 ～7 章由張杰編寫。在本書的編寫過程中，西北農(nóng)林科技大學(xué)樊明濤教授、河南科技大學(xué)古紹彬教授為我們提出了很多寶貴意見，在此表示感謝。
食品酶學(xué)領(lǐng)域科學(xué)技術(shù)發(fā)展迅速，新技術(shù)、新方法層出不窮，知識(shí)體系不斷豐富更新。筆者的認(rèn)識(shí)難免存在局限性，書中的疏漏和不當(dāng)之處懇請(qǐng)讀者批評(píng)指正。

編著者
2024年2月

第1章 緒論 1 
1.1 β-葡萄糖苷酶簡介 1
1.1.1 β-葡萄糖苷酶的分類  1
1.1.2 β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì) 2
1.1.3 β-葡萄糖苷酶酶活性的測定方法 3
1.1.4 β-葡萄糖苷酶的結(jié)構(gòu)與功能 4
1.1.5 β-葡萄糖苷酶的一般催化機(jī)制 6
1.2 不同來源的β-葡萄糖苷酶研究進(jìn)展 8
1.2.1 動(dòng)物來源的β-葡萄糖苷酶 8
1.2.2 植物來源的β-葡萄糖苷酶 9
1.2.3 微生物來源的β-葡萄糖苷酶 11
1.3 β-葡萄糖苷酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用 14
1.3.1 茶葉增香 16 
1.3.2 果汁增香 17 
1.3.3 葡萄酒增香 18 

第2章　酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的同源分析 20
2.1 基因的同源分析 20 
2.1.1 序列獲取 20 
2.1.2 理化性質(zhì)分析 21 
2.1.3 保守結(jié)構(gòu)域和Motif分析 21
2.1.4 進(jìn)化樹構(gòu)建 21 
2.2 同源分析結(jié)果 22 
2.2.1 理化性質(zhì)分析結(jié)果 22 
2.2.2 保守結(jié)構(gòu)域和Motif分析結(jié)果 23
2.2.3 同源關(guān)系分析結(jié)果 26 
2.3 討論 27 
2.4 本章小結(jié) 28 

第3章　酒酒球菌β-葡萄糖苷酶的異源表達(dá)和純化 29
3.1 酶的異源表達(dá)和純化 30 
3.1.1 試驗(yàn)材料與儀器 30 
3.1.2 主要儀器 30 
3.1.3 表達(dá)載體的構(gòu)建 31 
3.1.4 表達(dá)目的蛋白 37 
3.1.5 分離純化目的蛋白 38 
3.1.6 酶活性測定 39 
3.2 酶的異源表達(dá)與分離純化結(jié)果分析 40 
3.2.1 基因組DNA的提取 40
3.2.2 目的基因的克隆表達(dá) 41 
3.2.3 重組酶BGL0224的分離純化 44
3.3 討論 46 
3.4 本章小結(jié) 49 

第4章　重組β-葡萄糖苷酶BGL0224的酶學(xué)性質(zhì)表征 51
4.1 重組酶BGL0224的酶學(xué)性質(zhì)表征 52
4.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 52 
4.1.2　主要儀器 52 
4.1.3 生物信息學(xué)分析 52 
4.1.4 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測定 53 
4.1.5 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性測定 53
4.1.6 最適乙醇濃度及乙醇耐受性測定 54 
4.1.7 不同添加物對(duì)BGL0224酶活性的影響 54
4.1.8 結(jié)構(gòu)檢測 55 
4.1.9 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)常數(shù)測定 56 
4.2 酶學(xué)性質(zhì)的表征結(jié)果與分析 57 
4.2.1 BGL0224的生物信息學(xué)分析 57
4.2.2 BGL0224的基本理化性質(zhì) 60
4.2.3 BGL0224的結(jié)構(gòu)初步表征 63
4.2.4 BGL0224的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù) 65
4.3 討論 67 
4.4 本章小結(jié) 70 

第5章　重組β-葡萄糖苷酶BGL0224的催化機(jī)理探究 72
5.1 重組酶BGL0224的催化機(jī)理研究 73
5.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 73 
5.1.2 主要儀器 74 
5.1.3 最適溫度、最適pH測定 75
5.1.4 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)及活化能Ea測定 75
5.1.5 底物對(duì)重組酶的猝滅機(jī)制和結(jié)合能力檢測 75 
5.1.6 構(gòu)建BGL0224的三維結(jié)構(gòu)模型 75
5.1.7 BGL0224與底物的分子對(duì)接 76
5.1.8 BGL0224與底物的分子動(dòng)力學(xué)模擬 76
5.2 催化機(jī)理研究的結(jié)果與分析 77 
5.2.1 溫度和pH對(duì)BGL0224催化底物的影響 77
5.2.2 BGL0224催化底物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)和活化能 78
5.2.3 不同底物對(duì)BGL0224的猝滅機(jī)制和結(jié)合能力 82
5.2.4 BGL0224催化底物p-NPG的分子模擬 85 
5.3 討論 93 
5.4 本章小結(jié) 95 

第6章 重組β-葡萄糖苷酶BGL0224對(duì)赤霞珠葡萄酒品質(zhì)特性的影響 97 
6.1 探究β-葡萄糖苷酶對(duì)葡萄酒品質(zhì)的影響 98
6.1.1 試驗(yàn)材料與試劑 98 
6.1.2 主要儀器 98 
6.1.3 葡萄酒釀造工藝與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 99 
6.1.4 電子鼻測定方法 100 
6.1.5 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS）測定方法 100 
6.1.6 香氣感官評(píng)價(jià) 101 
6.2 結(jié)果與分析 101 
6.2.1 電子鼻分析 101 
6.2.2 GC-MS分析 105
6.2.3 感官評(píng)價(jià)分析 112 
6.3 討論 114 
6.4 本章小結(jié) 117 

第7章　β-葡萄糖苷酶研究展望 118

參考文獻(xiàn) 120 

附錄 135